E-液状キット 総乳糖（乳糖＋グルコース）

方法

β-ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）、ヘキソキナーゼ（HK）とグルコース-6-リン酸脱水素酵素（G6PDH）を用いた酵素UV試験法

測定原理

乳糖と元来のD-グルコースを分別せずに総合計量として定量します。試料中で遊離している元来のD-グルコースも測定され、乳糖量として算出されます。E-液状キットD-グルコース（Cat．No.E5140）を用いて共に測定する（遊離している元来のD-グルコース濃度を定量することにより、乳糖濃度が算出できます）必要があります。

保存条件および試薬の安定性

コンタミを避け、＋4℃で保存した場合、試薬類は表示の有効期限の月末まで安定です。凍結はしないで下さい。

警告および使用上の注意

1. 試薬は保存剤としてアジ化ナトリウム（0.95g/l）を含んでいます。飲み込まないようご注意下さい。また皮膚や粘膜に触れないようご注意下さい。
2. 研究用試薬を使用する場合に必要な使用上の注意をお守り下さい。

試薬調製

試薬類およびコントロールはそのまま直ぐに使用できます。

追加（その他測定に必要なもの）

蒸留水（無菌状態で重金属を含有してない）および一般的な実験用器具。乳糖とグルコースを分別測定するには、E-液状キット グルコース（Cat.No.E5140）が必要です。

包装内容および試薬濃度

R1	4×20.8 ml	バッファー β-ガラクトシダーゼ 清澄化試薬	pH6.6 ≧11ku/l
R2	4×5.5 ml	バッファー ATP NAD	pH7.8 10mmol/l 10mmol/l
R3	4×5.5 ml	HK G6PDHゼ（PGI）	≧1.5ku/l ≧1.5ku/l

測定操作

波長：340nm、Hg334nm、Hg365nm
光路長：1.00cm
温度：室温（＋20℃～）/＋37℃
測定対照：水

手動により以下の手順に従って測定する場合、試薬ブランクは試験のたびに測定し、結果の計算には試料の測定値から差し引いてください。試料ブランクは試料それ自身に測定への影響が考えられる時にのみ設定してください。

	試料 ブランク （SB）	試料	試料 ブランク （RB） （SBは必要 に応じ使用）
試料/コントロール 蒸留水 R1	－ 100μl 2000μl	100μl － 2000μl	100μl － 2000μl
混和し、＋37℃5分、あるいは室温（＋20℃～）15分経過後、 吸光度（A1）を測定します 次いでR3を添加します
R2 R3 蒸留水	500μl 500μl －	500μl 500μl －	500μl － 500μl
混和し、反応終了まで待って（＋37℃5分、 あるいは室温（20℃～）15分経過後）吸光度（A2）を測定します

注）R2とR3は予め混合しておき、一種類の試薬のようにして使用します。R2を1、R3を1（例 R2；5.5ml、R3；5.5ml）混合し、混合液の1000μlを測定に使用します。混合液は＋4℃で4週間安定ですが、光は遮蔽しておく必要があります。

乳糖/グルコースを分別せずに乳糖として計算

RBを使用して測定した場合：
　ΔA＝（A₂－df×A₁）試料－（A₂－df×A₁）_RB
SBを使用して測定した場合：
　ΔA＝（A₂－df×A₁）試料-（A₂－df×A₁）_SB-（A₂－df×A₁）_RB
　df；吸光度測定用に行った希釈、および反応液量を
　考慮した係数で、
　df＝（試料液量＋R1＋R2）/（試料液量＋R1＋R2＋R3）＝0.839
となる。

従って、計算式は以下のようになります。
　C乳糖/グルコース[]＝（V×MW×ΔA）/（ε×d×v×1000）
　V（終量）（反応液量）＝3100[μl]
　MW（分子量）＝342.3[g/mol]
　d（光路長）＝1.00[cm]
　v（試料液量）＝100[μl]
　ε（NADHの吸光係数）[ mmol^-1×cm^-1]：340nm＝6.3、334nm＝6.18、365nm＝3.4

よって、定量結果は以下のように計算されます。
　340nm：C乳糖/グルコース[g/l]＝1.684×ΔA
　334nm：＝1.717×ΔA
　365nm：＝3.121×ΔA

乳糖

C乳糖/グルコース[g/100g]は、遊離した元来のグルコースと、β-ガラクトシダーゼにより生成した乳糖由来のグルコースの総量を乳糖量として示しています。分別が必要であれば、遊離した元来のグルコースをE-液状キット グルコース（Cat.No.E5140）を用いて測定する必要があります。

乳糖の量は、乳糖/グルコースの測定値から遊離した元来のグルコース相当を引くことで計算されます。両分子の分子量から、以下のように計算されます。

　分子量比（乳糖/グルコース）＝342.3／180.16＝1.90
　C 乳糖[g/l]＝C 乳糖/グルコース-（Cグルコース×1.90）

キャリブレーション（校正）用および測定用コントロール

自動吸光度測定システム用、ならびに精度および正確度管理用内部標準として、自動分析用・糖類スタンダード（Cat.No.E1243，9ml）または用手法用・糖類スタンダード（Cat.No.E1242，9ml）をご使用下さい。コントロールは直ぐに使用できます。

特長

1. 測定範囲：
   本法は乳糖/グルコースの濃度（50～3000mg/l）を測定することができます（340nmで測定）。
   測定範囲の上限を超した場合は、試料を希釈して再測定してください。計算の際には希釈係数をかけます。
2. 特異性：
   　①本法は乳糖とD-グルコースを特異的に定量する方法です。
   　　試料中に乳糖のみ（グルコースは含まない）存在する場合は、HK、G6PDHの反応により、特異的に定量測定します。
   　②試料中にD-グルコースと乳糖の存在比が10:1以上（グルコースが多量）の場合、乳糖の測定精度が落ちます。
3. 検出限界：340nm測定で、4.1mg/lが乳糖/グルコースの最小検出濃度です。
   検出限界は、乳糖/グルコースを含まない試料を20回測定し、その標準偏差値を3倍した数値に相当します。